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RNA干扰沉默
Sp1
基因对大肠癌SW620细胞增殖转移能力的影响
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研究背景:
大肠癌(Colorectal cancer)是严重威胁人类生存的消化系统恶性肿瘤之一,在西方国家
恶性肿瘤的发病率中居第2位,在我国居常见恶性肿瘤第4位。大肠癌总的5年存活率较
低,因此早期发现、早期诊断与治疗大肠癌是提高生存率的关键。传统的治疗方法对肿瘤
特异性和敏感性差,副作用大,效果欠佳,近年来,由于分子生物学技术的发展,大肠癌
发生发展的分子机制研究取得了突破性进展,因此探寻大肠癌的基因治疗已成为目前研究
的热点。
转录因子特化蛋白1(Sp1)是一种核转录因子,其在肿瘤组织和细胞中的异常表达和活
化,可通过促进肿瘤相关生长因子和血管生成基因表达等机制,营造适宜肿瘤生长的局部
微环境,正向调节肿瘤增殖、转移潜能和血管生成。目前研究发现转录因子Sp1的异常表
达与肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等肿瘤的发生、发展、及其预后密切相关。但Sp1基因
在大肠癌中转录调控作用及其分子机制等研究工作国内尚无开展。因此探讨大肠癌中Sp1
基因的表达及其对大肠癌细胞生物学行为的影响,将有助于进一步明确Sp1基因在大肠癌
发生、发展中的作用及其可能机制,为大肠癌的预防和治疗提供切入点,在大肠癌的基因
治疗方面有较大的应用前景。
目的:
1.构建针对Sp1基因的RNA干扰真核表达载体,观察其对大肠癌SW620细胞Sp1基因表达
及活性的抑制作用。
2.探讨Sp1基因沉默后对大肠癌SW620细胞增殖转移的影响及相关基因的表达改变情
况,初步分析其发挥作用的可能机制。
方法:
1.设计合成针对Sp1基因的有短发夹结构的DNA序列,退火后克隆到RNA干扰表达载体
pGenesil-1质粒上,构建pGenesil-1-Sp1(+)和pGenesil-1-Sp1(-)重组质粒,并进行酶切鉴
定和DNA测序分析;脂质体介导转染SW620细胞后,提取总RNA及蛋白质,应用实时
荧光定量PCR、Western blot检测其对Sp1 mRNA及蛋白质表达水平的影响,凝胶迁移
率变动分析(EMSA)检测Sp1活性的变化。
2.采用细胞计数法绘制生长曲线、MTT法、流式细胞术、细胞划痕实验分别观察Sp1下调
后对SW620细胞增殖、细胞周期及凋亡和细胞迁移能力等生物学行为的影响。
3.脂质体介导pGenesil-1-Sp1(+)及pGenesi
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