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1. 荧光定量 PCR 概述 2
1.1 荧光定量 PCR 的主要概念 2
1.1.1 什么是荧光定量 PCR? 2
1.1.2 荧光定量 PCR 工作原理 3
1.1.3 优化的 qPCR 实验特点 4
2. 实验开始 8
2.1 总体注意事项 8
2.2 qPCR 实验设计注意事项 9
2.2.1 单重实验或多重实验?9
2.2.2 方法选择 9
2.2.2.1 DNA 结合染料 10
2.2.2.2 基于荧光标记的引物或探针的化学机理 12
2.3 SYBR Green I 反应设计及优化 19
2.3.1 引物和扩增子的设计 19
2.3.2 实验体系的确定及优化 20
2.3.2.1 退火温度的优化 20
2.3.2.2 用标准曲线进行反应的评估 22
2.4 TaqMan 探针反应设计及优化 23
2.4.1 引物和探针设计 23
2.4.2 实验体系的确定及优化 24
3. 多重实验注意事项 28
3.1 多重实验的引物及探针设计 28
3.2 多重实验的报告基团和淬灭基团选择 29
3.3 多重实验前单个实验的优化 29
3.4 多重实验的验证 29
3.5 多重实验的优化 30
4. 荧光定量 PCR 数据分析 34
4.1 绝对定量 35
4.1.1 什么时候使用绝对定量? 35
4.1.2 使用标准曲线进行绝对定量 35
4.2 相对定量 37
4.2.1 什么时候使用相对定量 37
4.2.2 用质量单位作为标准进行相对定量 38
4.2.3 用参照基因作为标准进行相对定量 40
4.2.3.1 2–∆∆CT (Livak) 方法 41
4.2.3.2 用参照基因的 ∆CT 法 42
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